RIPA裂解液  (強(qiáng))

產(chǎn)品描述

RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液，是一種經(jīng)典的動物組織/細(xì)胞快速裂解液，通過組合離子型去垢劑和非離子去污劑對組織細(xì)胞的消化作用使組織細(xì)胞崩解釋放出蛋白質(zhì)，對細(xì)胞膜、胞漿亞組分、胞核成分均有較強(qiáng)裂解作用。適用于PAGE、Western Blotting和免疫沉淀(IP)的研究。

李記生物RIPA裂解液 (強(qiáng)) 不含PMSF組分；適用PAGE、Western Blotting和免疫沉淀(IP)的研究。

訂購信息

運(yùn)輸與保存

常溫運(yùn)輸。4℃保存，有效期12個月。

配方表

25mM Tris•HCl，150mM NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，pH 7.6

使用方法

貼壁細(xì)胞

1.      取適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA) （貨號:AP02L084） 或PMSF（終濃度為 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

2.      去除細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的 PBS 洗滌兩次。按照6孔板每孔加入150-200ul 的裂解液的比例均勻加入裂解液，如果細(xì)胞密度過高可增加裂解液的量至250-300 uL?！咀ⅰ浚毫呀庖哼^少會使細(xì)胞裂解不充分，影響蛋白提取的質(zhì)量。

3.      用槍吹打數(shù)下，冰上放置10 min，期間每隔2 min用槍吹打數(shù)下。

4.      轉(zhuǎn)移細(xì)胞裂解液于1.5 mL EP管中。

5.      12,000 g，4℃ 離心5min。

6.      收集上清。

懸浮細(xì)胞

1.      取適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA) （貨號:AP02L084） 或PMSF(終濃度為 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

2.      收集細(xì)胞0.5~2x10⁷于1.5mL離心管中，1mL預(yù)冷的PBS洗滌兩次，1,000xg 離心3 min，棄上清，重復(fù)三次。

3.      按照6孔板每孔加入150-200uL 的裂解液的比例均勻加入裂解液，如果細(xì)胞密度過高可增加裂解液的量至250-300uL。【注】：裂解液過少會使細(xì)胞裂解不充分，影響蛋白提取的質(zhì)量。

4.      用槍吹打數(shù)下并劇烈震蕩，冰上放置10 min，期間每隔2 min震蕩一次。

5.      12,000 g，4℃ 離心5 min。

6.      收集上清。

組織樣品

1.      把組織剪成細(xì)小的碎片。

2.      取適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA) （貨號:AP02L084） 或PMSF(終濃度為 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

3.      按照每100mg組織加入1mL裂解液的比例加入裂解液（如裂解不充分可適當(dāng)增加裂解液，如果需要增加蛋白濃度可適當(dāng)減少使用的裂解液體積）。

4.      用勻漿器勻漿，直至充分裂解（為防止蛋白降解請于冰上操作）。

5.      12,000 g，4℃ 離心5 min。

6.      收集上清。

注意事項(xiàng)

1.         本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2.         如需檢測磷酸化蛋白，則需要額外添加磷酸酶抑制劑II cocktail（50×）(貨號:AP03L025) 。

3.         RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正?，F(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復(fù)合物。在不檢測基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

4.         RIPA裂解液（強(qiáng)）含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定蛋白。

5.         如果組織樣品本身非常細(xì)小，可以適當(dāng)剪切后直接加入裂解液裂解，通過強(qiáng)烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。直接裂解的優(yōu)點(diǎn)是比較方便，不必使用勻漿器，缺點(diǎn)是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

6.         通常6孔板每孔細(xì)胞加入150 μL裂解液已經(jīng)足夠，但如果細(xì)胞密度非常高可以適當(dāng)加大裂解液的用量到200 μL或250 μL。

表1: RIPA裂解液的使用量

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